Dagli orologi primordiali agli oscillatori circadiani

May 31, 2023

Natura volume 616, pagine 183–189 (2023) Citare questo articolo

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I ritmi circadiani svolgono un ruolo essenziale in molti processi biologici e sono necessarie solo tre proteine ​​procariotiche per costituire un vero oscillatore circadiano post-traduzionale1. La storia evolutiva delle tre proteine ​​Kai indica che KaiC è il membro più antico e un componente centrale dell'orologio2. Successive aggiunte di KaiB e KaiA regolano lo stato di fosforilazione di KaiC per la sincronizzazione temporale. Il sistema canonico KaiABC nei cianobatteri è ben compreso3,4,5,6, ma si sa poco dei sistemi più antichi che possiedono solo KaiBC. Tuttavia, secondo alcuni rapporti, potrebbero esibire un meccanismo di cronometraggio basilare, simile a una clessidra7,8,9. Qui indaghiamo l'orologio circadiano primordiale del Rhodobacter sphaeroides, che contiene solo KaiBC, per chiarire il suo funzionamento interno nonostante la mancanza di KaiA. Utilizzando una combinazione di cristallografia a raggi X e microscopia elettronica criogenica, troviamo una nuova piega dodecamerica per KaiC, in cui due esameri sono tenuti insieme da un fascio di 12 eliche. Questa interazione è formata dall'estensione carbossi-terminale di KaiC e funge da antica porzione regolatrice che viene successivamente sostituita da KaiA. Uno spostamento del registro a spirale tra le conformazioni diurne e notturne è collegato ai siti di fosforilazione attraverso una rete allosterica a lungo raggio che si estende per oltre 140 Å. I nostri dati cinetici identificano la differenza nel rapporto ATP/ADP tra giorno e notte come segnale ambientale che guida l’orologio. Svelano anche dettagli meccanicistici che fanno luce sull'evoluzione degli oscillatori autosufficienti.

Gli orologi circadiani sono oscillatori biologici autosufficienti che si trovano ubiquitariamente negli organismi procarioti ed eucariotici. Negli eucarioti, questi sistemi sono complessi e altamente sofisticati, mentre nei procarioti il ​​meccanismo centrale è regolato da un oscillatore post-traduzionale che può essere ricostituito in vitro con ATP e tre proteine ​​(codificate da kaiA, kaiB e kaiC)1. Il lavoro fondamentale sul sistema KaiABC ha portato a una comprensione completa del suo orologio circadiano. KaiC è il componente centrale che si autofosforila legandosi a KaiA e si autodefosforila in seguito all'associazione con KaiB3,4,5,6. È stato dimostrato in vitro che l'interazione tra queste tre proteine ​​costituisce un vero oscillatore circadiano caratterizzato da persistenza, ripristino e compensazione della temperatura. Di conseguenza, il sistema KaiABC è considerato l'implementazione elegante e più semplice del ritmo circadiano. La storia evolutiva dei geni kai ha stabilito che kaiC è il membro più antico risalente a circa 3,5 miliardi di anni fa. Successive aggiunte di kaiB e più recentemente di kaiA hanno formato rispettivamente i cluster kaiBC e kaiABC esistenti2,10. In particolare, alcuni studi su organismi più primitivi privi di kaiA hanno suggerito che i sistemi basati su kaiBC potrebbero già fornire un meccanismo di cronometraggio di base, simile a una clessidra7,8,9. Contrariamente agli oscillatori autosufficienti presenti nei cianobatteri, un timer di questo tipo richiede un segnale ambientale per azionare l’orologio e per il movimento quotidiano della clessidra. Il ruolo centrale dei ritmi circadiani in molti processi biologici, controllati dal ciclo diurno e notturno sulla Terra, rende la loro evoluzione un argomento affascinante.

Qui indaghiamo un orologio circadiano così primitivo attraverso studi biochimici e strutturali del sistema KaiBC del proteobatterio fotosintetico viola, senza zolfo, R. sphaeroides KD131 (di seguito, i suoi componenti sono indicati come KaiBRS e KaiCRS). L'organismo mostra ritmi sostenuti di espressione genica in vivo, ma se kaiBC sia responsabile di questa osservazione rimane inconcludente in assenza di un knockout kaiC11. Uno studio precedente sul batterio strettamente correlato Rhodopseudomonas palustris che utilizzava un ceppo knockout ha dimostrato la causalità tra il ritmo proto-circadiano della fissazione dell'azoto e l'espressione del gene kaiC9. Qui, attraverso esperimenti in vitro, scopriamo che KaiBCRS è un orologio circadiano primordiale con un meccanismo diverso dall'oscillatore circadiano ampiamente studiato nel Synechococcus elongatus PCC 7942 (di seguito, i suoi componenti saranno indicati come KaiASE, KaiBSE e KaiCSE)3,4 ,5,6. Identifichiamo un segnale ambientale che regola lo stato di fosforilazione e di conseguenza produce un orologio di 24 ore in vivo come interruttore nel rapporto ATP-ADP tra giorno e notte. I nostri risultati da studi cinetici combinati con strutture a raggi X e microscopia elettronica criogenica (crio-EM) degli stati rilevanti svelano un percorso allosterico a lungo raggio che è cruciale per la funzione della clessidra e fa luce sull'evoluzione dell'autosostentamento oscillatori. In particolare, troviamo una nuova piega proteica per KaiCRS e scopriamo uno spostamento di registro nel dominio della bobina che si estende per circa 115 Å come regolatore chiave in questo sistema, che mostra somiglianze strutturali con la segnalazione della dineina12.